基于細(xì)胞培養(yǎng)法的rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測(cè)方法，該方法的原理是通過(guò)不斷的細(xì)胞傳代使得rcAAV實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增，之后再利用qPCR或Southern-blot的方法對(duì)rcAAV進(jìn)行檢測(cè)，能保證檢測(cè)到的rcAAV都具有復(fù)制能力，是目前常用的檢測(cè)方法。然而，其檢測(cè)敏感性依賴(lài)于rcAAV對(duì)靶細(xì)胞的感   染效率，相較于AAV2型來(lái)說(shuō)許多其他AAV血清型（1、3、5、6、7）在培養(yǎng)過(guò)程中不能有效地感   染靶細(xì)胞（例如HEK293/293T細(xì)胞），導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低，因此其檢測(cè)值有可能會(huì)低于實(shí)際值。復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)。鄭州正揚(yáng)生物重組腺相關(guān)病毒檢測(cè)服務(wù)

RCL復(fù)制型慢病毒檢測(cè)的背景：CAR-T（chimericantigenreceptorT-cellimmunotherapy），即嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。它是一種醫(yī)治種瘤的新型精確靶向療法，能夠精確、高效，且有希望治好ai癥的免疫醫(yī)治方法。目前，主要有兩種病毒載體用于CAR-T細(xì)胞基因轉(zhuǎn)導(dǎo)：γ逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體。目前基因醫(yī)治產(chǎn)品所用慢病毒載體均是非復(fù)制型的，但在病毒包裝過(guò)程中，可能會(huì)由于同源或非同源重組等機(jī)制產(chǎn)生復(fù)制型慢病毒(RCL)。出于安全、有效、質(zhì)量可控的考慮，應(yīng)當(dāng)對(duì)該類(lèi)病毒進(jìn)行檢測(cè)，以避免在人體內(nèi)無(wú)控地自我復(fù)制，造成傷害，防止發(fā)生臨床安全性隱患事件。合肥正揚(yáng)生物復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測(cè)廠(chǎng)家qPCR法復(fù)制型慢病毒檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)有哪些？

生物檢測(cè)通常用于篩選載體產(chǎn)品中的RCR，而對(duì)輸注后患者的監(jiān)測(cè)則依賴(lài)于分子或血清學(xué)檢測(cè)。分子和血清學(xué)檢測(cè)比生物檢測(cè)更快，消耗的資源更少；然而，它們也很容易給出誤報(bào)。蕞常用的RCR病毒檢測(cè)是擴(kuò)展的S+/L-測(cè)定和標(biāo)記拯救測(cè)定。蕞常見(jiàn)的RCL生物測(cè)定方法是通過(guò)在增殖階段將包裝細(xì)胞中的潛在RCL擴(kuò)增至更高滴度，然后進(jìn)行ELISA或分子測(cè)定。迄今為止，在病毒載體、轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞產(chǎn)物或受體患者中尚未報(bào)告陽(yáng)性RCR/RCL結(jié)果。因此，一些研究人員建議，可能是時(shí)候修改FDA指南中對(duì)RCR/RCL監(jiān)測(cè)的要求。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心(CDE)發(fā)布了《體內(nèi)基因治   療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，對(duì)基因治    療產(chǎn)品的質(zhì)量屬性分析給出了指導(dǎo)意見(jiàn)，強(qiáng)調(diào)基于質(zhì)量研究和關(guān)鍵質(zhì)量屬性（Criticalqualityattributes,CQA）的鑒別建立完善的質(zhì)量控制策略，常見(jiàn)的質(zhì)量研究項(xiàng)目包括但不限于鑒別、結(jié)構(gòu)分析、生物學(xué)活性、純度、雜質(zhì)、含量、轉(zhuǎn)染/感    染效率、一般理化特性等。rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒作為生產(chǎn)過(guò)程中的工藝雜質(zhì)，其限度尚未有明確的標(biāo)準(zhǔn)要求，行業(yè)普遍建議rAAV病毒原液或終產(chǎn)品（比原液多了分裝的工藝）中的rcAAV的含量應(yīng)小于1rcAAV/10?rAAVvectorgenome，因此必須采用高靈敏度的方法才能對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)和定量分析。目前rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測(cè)常采用2種方法，即基于細(xì)胞培養(yǎng)的檢測(cè)方法和qPCR快檢法。為什么要做復(fù)制型逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)？

rcAAV復(fù)制型腺相關(guān)病毒檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光定量PCR法）的原理：實(shí)時(shí)熒光定量PCR是基于PCR擴(kuò)增時(shí)，在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，產(chǎn)物的增加可以通過(guò)熒光信號(hào)指示，通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣本中初始模板進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR可實(shí)時(shí)檢測(cè)產(chǎn)物的生成量，通過(guò)加入已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后根據(jù)待測(cè)樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中的位置推算初始模板的濃度，從而達(dá)到檢測(cè)宿主細(xì)胞殘留DNA含量的目的。CAR-T細(xì)胞醫(yī)治產(chǎn)品中重組腺相關(guān)病毒檢測(cè)的監(jiān)管要求。寧波qPCR法病毒檢測(cè)產(chǎn)品

為什么要做復(fù)制型病毒檢測(cè)？鄭州正揚(yáng)生物重組腺相關(guān)病毒檢測(cè)服務(wù)

復(fù)制性慢病毒/復(fù)制性逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測(cè)的必要性：RCL/RCR會(huì)同逆轉(zhuǎn)錄病毒載體一樣，整合在細(xì)胞基因組中，從而產(chǎn)生因整合導(dǎo)致的原ai基因激  活，抑ai基因破壞或者使促細(xì)胞生長(zhǎng)的因子高度表達(dá)而造成二次仲瘤的風(fēng)險(xiǎn)。因其具有復(fù)制性，即產(chǎn)生具有復(fù)制能力的病毒，增加了因整合而造成的二次仲瘤的風(fēng)險(xiǎn)。雖然目前在病毒制備體系方面改進(jìn)很多，很大程度上降低了RCL/RCR產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)，但是仍不能完全排除，美國(guó)FDA要求對(duì)于γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和慢病毒載體，需要在整個(gè)生產(chǎn)過(guò)程及不同階段進(jìn)行RCL/RCR檢測(cè)，需要對(duì)載體生產(chǎn)用主細(xì)胞庫(kù)、工作細(xì)胞庫(kù)、生產(chǎn)終末細(xì)胞、載體上清液及在體外培養(yǎng)超過(guò)4天的載體轉(zhuǎn)到細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，鄭州正揚(yáng)生物重組腺相關(guān)病毒檢測(cè)服務(wù)