CAR-T細胞的微生物安全風險可能涉及細菌、真   菌、支原體、外來病毒和來自載體生產(chǎn)的具有復制能力的病毒的污染。微生物安全問題需要高度關(guān)注，因為在生產(chǎn)過程中很容易發(fā)生微生物污染，而且蕞終的細胞產(chǎn)品無法凈化。CAR-T細胞的微生物安全主要通過對生產(chǎn)材料的嚴格檢測、按照CGMP要求嚴格控制生產(chǎn)過程、對產(chǎn)品進行微生物檢測來保證，檢測內(nèi)容包括無菌檢測、支原體檢查、可復制型病毒檢測、微生物檢測。南京正揚生物目前可提供支原體快檢和可復制型病毒檢測相關(guān)產(chǎn)品。南京正揚有復制型病毒檢測試劑盒試劑盒嗎？寧波qPCR法病毒檢測

慢病毒載體是以人類免疫缺陷Ⅰ型病毒（humanimmunodeficiencyvirus，HIV-1）為基礎發(fā)展起來的基因醫(yī)治載體，屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族，又區(qū)別于一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體具有更強的感   染能力，具有容納外源性目的基因片段大、穩(wěn)定整合、持久表達、免疫反應小等優(yōu)點，是常用的基因轉(zhuǎn)移載體。而載體作為基因醫(yī)治的工具，可能帶來插入突變、復制型病毒、外源因子污染等風險，同時其攜帶的遺傳物質(zhì)是CAR-T細胞的重要組成部分，是使T細胞具有強大的識別和殺傷腫瘤細胞活性的重要基礎，考慮到病毒載體技術(shù)的廣泛應用，具有復制能力的慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測成為重要問題，F(xiàn)DA及歐盟先后出臺相關(guān)文件，要求建立靈敏、可靠的復制能力的慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒檢測方法。上海正揚生物病毒檢測優(yōu)缺點為什么要做重組腺相關(guān)病毒檢測？

實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)在生物制品質(zhì)量控制方面應用非常普遍，如宿主細胞殘留DNA檢測，鼠源、禽源等外源病毒檢測，微生物快檢（支原體、分枝桿菌、細菌、真  菌等），復制型病毒檢測（RCL、RCR、rcAAV等）、質(zhì)?？截悢?shù)檢測及其它工藝雜質(zhì)檢測等。qPCR檢測結(jié)果以擴增曲線圖呈現(xiàn)，正常擴增曲線為S型，分為基線期、指數(shù)擴增期、線性擴增期和平臺期；線形光滑、拐點清晰，基線平直或略微下降，無明顯上揚。定量檢測實驗中，對標曲的要求主要從斜率（與擴增效率相關(guān)）和R2兩方面進行考察，要求斜率滿足-3.8~-3.1（對應擴增效率為83.3%~110%），R2滿足高于0.99。

RCL/RCR病毒檢測的方法FDA推薦的RCL檢測方法是利用敏感細胞對病毒載體中可能存在的RCL進行培養(yǎng)擴增，并在培養(yǎng)終點進行檢測。?擴增期：將待測物與對HIV-1易感并且可大量擴增病毒的細胞系(通常用C8166)孵育，細胞傳代5次以上，培養(yǎng)至少3周。?指示期：3周后收集培養(yǎng)上清，接種于C8166細胞中培養(yǎng)7d后檢測RCL標志物。?檢測：A：P24ELLISA的方法：適用于由載體制備過程中病毒基因組之間的重組形成RCL的檢測。B：PERT法：當RCL進行擴增后，也可應用PERT檢測方法測定逆轉(zhuǎn)錄酶活性。該方法的缺點是在某些細胞中存在高背景。C：qPCR方法：采用實時定量PCR方法(Q-PCR)測定假型病毒復制型慢病毒檢測請聯(lián)系南京正揚。

《中國藥典》2020版三部《人用基因醫(yī)治制品總論》以及CDE發(fā)布的細胞基因醫(yī)治相關(guān)的技術(shù)指導原則中均提到，在設計為復制缺陷型或條件復制型載體的情況下，應分析是否存在殘留的復制型或野生型載體及其水平。南京正揚生物科技有限公司自主研發(fā)生產(chǎn)的復制性腺相關(guān)病毒檢測試劑盒，可同時分別精確測定樣品中高濃度的目標載體和低濃度的復制型載體濃度，從而有效地提高了方法靈敏度，滿足法規(guī)要求的無復制型腺相關(guān)病毒（rcAAV）的污染，可用于GMP生產(chǎn)的rAAV質(zhì)量控制。重組腺相關(guān)病毒檢測。杭州rcAAV病毒檢測服務

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實時定量PCR方法(Q-PCR法)復制型慢病毒檢測原理：目前許多CAR-T申報企業(yè)采用Q-PCR／PCR方法直接測定終產(chǎn)品中的VSV-G序列或psi—gag序列，考慮到細胞產(chǎn)品一般需要新鮮輸注或快速凍存的特殊性，采用基于細胞培養(yǎng)方法，時間周期較長，建議在細胞產(chǎn)品制備過程中進行多面控制(如對慢病毒載體及生產(chǎn)終末細胞采用基于細胞培養(yǎng)方法測定RCL，以確保生產(chǎn)工藝過程中不存在RCL的風險)，細胞終產(chǎn)品階段可采用快速放行方法(如PCR方法)?；赒-PCR法測定復制型慢病毒載體，主要是針對VSV-G序列設計定量引物，通過繪制標準曲線，對RCL予以定量。寧波qPCR法病毒檢測

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