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石家莊外泌體DNA提取

來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-06-02

DNA提取定量:分光光度法:測(cè)定DNA在A260的光吸收,計(jì)算濃度。雙鏈DNA:A260*稀釋倍數(shù)*50(ug/ml)單鏈DNA:A260*稀釋倍數(shù)*40(ug/ml)單鏈核苷酸DNA:A260*稀釋倍數(shù)*20(ug/ml).瓊脂糖平板法:在含溴乙錠的瓊脂糖平板上滴1-5ul樣品DNA和已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品,放置數(shù)小時(shí)后檢測(cè)。微型凝膠電泳:將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)電泳,染色,比較熒光強(qiáng)度。DNA提取之貯存:短期儲(chǔ)存:4℃或-20℃存放于TE緩沖液中。長(zhǎng)期貯存:在70%乙醇,或在DNA溶液中加一滴氯仿,-70℃保存。DNA提取是從細(xì)胞或組織中提取純化DNA的過(guò)程。石家莊外泌體DNA提取

DNA提取的幾種方法介紹,濃鹽法:利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同,將二者分離,常用的方法是用1M氯納提取化鈉抽提,得到的DNP黏液與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化,再離心除去蛋白質(zhì),此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間,而DNA位于上層水相中,用2倍體積95%乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)。也可用0.15MNaCL液反復(fù)洗滌細(xì)胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脫氧核糖蛋白,再按氯仿---異醇法除去蛋白。兩種方法比較,后種方法使核酸降解可能少一些。廣州無(wú)需氯仿RNA提取試劑研發(fā)DNA提取的樣品準(zhǔn)備之血液樣品:血液抗凝易用檸檬酸抗凝液。

microRNA提取方法及步驟:頭一次使用前請(qǐng)先在70%乙醇、WashSolution1瓶和WashSolution2/3瓶中加入指定量乙醇!a.收集<107懸浮細(xì)胞到一個(gè)1.5ml離心管。(對(duì)于貼壁細(xì)胞,孔板培養(yǎng)和細(xì)胞瓶培養(yǎng)可以直接裂解,盡可能吸干凈所有培養(yǎng)液殘留后直接加入1ml的Lysis/Bindingbuffer,迅速輕搖使Lysis/Bindingbuffer充分和瓶底所有細(xì)胞接觸裂解細(xì)胞并滅活RNA酶,輕輕用移液槍反復(fù)吹打混勻。)b.13,000rpm離心10秒(或者300g離心5分鐘),使細(xì)胞沉淀下來(lái)。完全吸棄上清,留下細(xì)胞團(tuán),注意不完全棄上清會(huì)稀釋裂解液導(dǎo)致產(chǎn)量純度降低。c.輕彈管壁將細(xì)胞沉淀完全松散重懸,加入1mlLysis/Bindingbuffer,渦旋或者吹打,充分裂解混勻。

RNA提取中常見(jiàn)的問(wèn)題:OD260/OD280比值偏低:蛋白質(zhì)污染:確保不要吸入中間層及有機(jī)相。減少起始樣品量,確保裂解完全、徹底。加入氯仿后首先要充分混勻,并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。如果所得RNA的OD260/OD280比值偏低,則用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。苯酚殘留:確保不要吸入中間層及有機(jī)相。加入氯仿后首先要充分混勻,并且離心分層的離心力和時(shí)間要足夠。多糖或多酚的殘留:一些特殊的組織和植物中,多糖、多酚含量較多,這些殘留也會(huì)導(dǎo)致OD260/OD280比值偏低。因此,從這類材料中提取RNA時(shí),需要注意多糖、多酚雜質(zhì)的去除。設(shè)備限制:測(cè)定OD260及OD280數(shù)值時(shí),要使OD260讀數(shù)在0.1-0.5之間。此范圍線性較好。用水稀釋樣品:測(cè)OD值時(shí),對(duì)照及樣品稀釋液請(qǐng)使用10mMTris,pH7.5。用水作為稀釋液將導(dǎo)致比值偏低。DNA提取的樣品準(zhǔn)備之培養(yǎng)細(xì)胞:懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞:1500g離心,4℃10分種收集細(xì)胞。

RNA提取一般在pH值低于7時(shí)進(jìn)行。在堿性pH值下,由于核糖的2'位置存在OH基團(tuán),RNA更容易被堿性水解降解。此外,RNA在酸性pH值下傾向于保留在水相中。外泌體DNA提取注意事項(xiàng):1.實(shí)驗(yàn)過(guò)程中較好戴一次性干凈手套、口罩,使用超純水。2.如樣本量不足200μL,請(qǐng)用0.85%生理鹽水補(bǔ)至200μL。RNA提取中常見(jiàn)的問(wèn)題之RNA中有基因組DNA污染:材料中核酸含量高:脾臟、胸腺等組織中的核酸含量較高,可進(jìn)行多次酚/氯仿抽。提以去除多余的DNA。也可以在提取后加入DNaseI處理,降解DNA。材料過(guò)量:增加試劑用量。RNA提取可以使用不同的組織或細(xì)胞類型來(lái)比較RNA的表達(dá)。廣州無(wú)需氯仿RNA提取試劑研發(fā)

DNA提取的樣品準(zhǔn)備之生物組織:液氮?jiǎng)驖{法。石家莊外泌體DNA提取

骨組織RNA提取方法及步驟:適用于快速提取骨組織細(xì)胞總RNA,使用獨(dú)有基因組DNA清理柱技術(shù)可有效清理電泳可見(jiàn)gDNA殘留,RNA可用于反轉(zhuǎn)錄PCR,熒光定量PCR等。骨組織堅(jiān)硬、骨細(xì)胞密度低、而且外周基質(zhì)含有大量黏蛋白(蛋白多糖)和RNA難以分離,無(wú)法用傳統(tǒng)Trizol法進(jìn)行高質(zhì)量提取。本方法采用獨(dú)有的不含苯酚/氯仿配方的裂解液,并添加多種成分去除骨組織蛋白多糖。同時(shí)獨(dú)特基因組DNA清理柱技術(shù)可以有效清理gDNA殘留,得到的RNA一般不需要DNase消化,可用于反轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR等實(shí)驗(yàn)。獨(dú)特的裂解液迅速裂解細(xì)胞和滅活細(xì)胞RNA酶,離心沉淀去除多糖和次級(jí)代謝產(chǎn)物,然后裂解混合物用乙醇調(diào)節(jié)RNA結(jié)合吸附到基因組DNA清理柱,然后RNA被選擇性洗脫濾過(guò),吸附在基因組DNA清理柱上的殘留DNA無(wú)法洗脫連同柱子一起丟棄從而清理掉DNA。濾過(guò)的RNA用乙醇調(diào)節(jié)結(jié)合條件后,RNA在高離序鹽狀態(tài)下選擇性吸附于離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜,再通過(guò)一系列快速的漂洗-離心的步驟,去蛋白液和漂洗液將細(xì)胞代謝物,蛋白等雜質(zhì)去除,較后低鹽的RNasefreeH20將純凈RNA從硅基質(zhì)膜上洗脫。石家莊外泌體DNA提取

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