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實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀,由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成,用來監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光。與實(shí)時(shí)設(shè)備相連的計(jì)算機(jī)收集熒光數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析軟件以圖表的形式顯示。原始數(shù)據(jù)被繪制成熒光強(qiáng)度相對(duì)于循環(huán)數(shù)的圖表。原始數(shù)據(jù)收集后可以開始分析。實(shí)時(shí)設(shè)備的軟件能使收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行正?;幚韥韽浹a(bǔ)背景熒光的差異。正?;罂梢栽O(shè)定域值水平,這就是分析熒光數(shù)據(jù)的水平。實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀組成熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)作用,監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光,數(shù)據(jù)形式顯示,通過開發(fā)的實(shí)時(shí)分析,軟件以圖表的表現(xiàn)。實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀優(yōu)勢(shì):樣品到達(dá)域值水平所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)稱為Ct值(限制點(diǎn)的循環(huán)數(shù))。域值應(yīng)設(shè)定在使指數(shù)期的擴(kuò)增效率為大,這樣可以獲得準(zhǔn)確,可重復(fù)性的數(shù)據(jù)。如果同時(shí)擴(kuò)增的還有標(biāo)有相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品,線性回歸分析將產(chǎn)生一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以用來計(jì)算未知樣品的濃度。實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀技術(shù)原理:所謂real-timeQ-PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因,利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。在real-time技術(shù)的發(fā)展過程中,兩個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)起著關(guān)鍵的作用:(1)在90年代早期,TaqDNA多聚酶的5′核酸外切酶活性的發(fā)現(xiàn)。 基于聚合酶制造的PCR儀實(shí)際就是一個(gè)溫控設(shè)備,能在變性溫度,復(fù)性溫度,延伸溫度之間很好地進(jìn)行控制。上海實(shí)時(shí)定量PCR儀價(jià)格便宜
儀器制冷部件可以在完成擴(kuò)增后降溫至4℃,保存樣品過夜。缺點(diǎn):管內(nèi)反應(yīng)液溫度比鋁塊顯示溫度滯后;須使用特制且與鋁塊凹孔形狀緊密吻合的薄壁耐熱反應(yīng)管;變溫時(shí)難以快速克服鋁塊的熱容量;壓縮機(jī)制冷啟動(dòng)慢、重量大、滯后時(shí)間長(zhǎng)。2.水浴式PCR儀儀器本身有3個(gè)不同溫度的水浴,用機(jī)械裝置將帶有反應(yīng)管的架子移位和升降溫度,使溫度循環(huán)。優(yōu)點(diǎn):水為傳熱介質(zhì),溫度易恒定,熱容量大;反應(yīng)管形狀無特殊要求,溫度轉(zhuǎn)換較快擴(kuò)增效果穩(wěn)定;具有較高的運(yùn)行效率,擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好。缺點(diǎn):高溫浴不穩(wěn)定,水面需用液體石蠟覆蓋;改變水浴溫度所需時(shí)間較長(zhǎng),不易實(shí)施復(fù)雜程序(如套式PCR)的操作,儀器體積較大;室溫影響溫度下限。3.變溫式流式PCR儀依據(jù)空氣流的動(dòng)力學(xué)原理,以冷熱氣流為介質(zhì)升降溫度。優(yōu)點(diǎn):變溫迅速,擴(kuò)增效果好,適合于微量、快速PCR;反應(yīng)器不受形狀限制,管外無需涂液體石蠟;測(cè)定管內(nèi)液體溫度作為控溫依據(jù),顯示溫度真實(shí)可靠;易于用微電腦設(shè)定復(fù)雜的變溫程序;易于制成重量較輕的便攜式儀器,適合外出作業(yè)。缺點(diǎn):以室溫為溫度下限,低溫難控制,對(duì)空氣流的動(dòng)力學(xué)要求較高,需精心設(shè)計(jì)才能使各管溫度均勻。 上海實(shí)時(shí)定量PCR儀價(jià)格便宜實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀,由熒光定量系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)組成,用來監(jiān)測(cè)循環(huán)過程的熒光。
1988年初,Keohanog改用T4DNA聚合酶進(jìn)行PCR,其擴(kuò)增的DN段很均一,真實(shí)性也較高,只有所期望的一種DN段。但每循環(huán)一次,仍需加入新酶。1988年Saiki等從溫泉中分離的一株水生嗜熱桿菌thermusaquaticus中提取到一種耐熱DNA聚合酶。此酶具有以下特點(diǎn):①耐高溫,在70℃下反應(yīng)2h后其殘留活性大于原來的90%,在93℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的60%,在95℃下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來的40%。②在熱變性時(shí)不會(huì)被鈍化,不必在每次擴(kuò)增反應(yīng)后再加新酶。③提高了擴(kuò)增片段特異性和擴(kuò)增效率,增加了擴(kuò)增長(zhǎng)度。由于提高了擴(kuò)增的特異性和效率,因而其靈敏性也提高。為與大腸桿菌多聚酶IKlenow片段區(qū)別,將此酶命名為TaqDNA多聚酶TaqDNAPolymerase。此酶的發(fā)現(xiàn)使PCR的被應(yīng)用。
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引物設(shè)計(jì)時(shí)使合成的寡核苷酸鏈(18~24聚物)適用于多種實(shí)驗(yàn)條件仍不失為明智之舉。②引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括引物自身二聚體、發(fā)卡結(jié)構(gòu)、引物間二聚體等。這些因素會(huì)影響引物和模板的結(jié)合從而影響引物效率。對(duì)于引物的3’末端形成的二聚體,應(yīng)控制其ΔG大于,因?yàn)榇朔N情形的引物二聚體有進(jìn)一步形成更穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的可能性,引物中間或5’端的要求可適當(dāng)放寬。引物自身形成的發(fā)卡結(jié)構(gòu),也以3’端或近3’端對(duì)引物-模板結(jié)合影響更大;影響發(fā)卡結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性的因素除了堿基互補(bǔ)配對(duì)的鍵能之外,與莖環(huán)結(jié)構(gòu)形式亦有很大的關(guān)系。應(yīng)盡量避免3’末端有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的引物。③引物GC含量和Tm值PCR引物應(yīng)該保持合理的GC含量。含有50%的G+C的20個(gè)堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56~62℃范圍內(nèi),這可為有效退火提供足夠熱度。一對(duì)引物的GC含量和Tm值應(yīng)該協(xié)調(diào)。協(xié)調(diào)性差的引物對(duì)的效率和特異性都較差,因?yàn)榻档土薚m值導(dǎo)致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高,其錯(cuò)誤引發(fā)的機(jī)率也越大。若采用太高的退火溫度,Tm值低的引物對(duì)可能完全不發(fā)揮作用。在從一批在特定序列范圍內(nèi)已合成好的寡核苷酸中選擇一對(duì)新的引物時(shí),這種GC含量和Tm值的協(xié)調(diào)非常關(guān)鍵。一般來說。 PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物.力康基因擴(kuò)增PCR儀價(jià)格比較
熒光定量PCR儀是以熒光染料或熒光標(biāo)記探針偵測(cè)每次聚合酶鏈鎖反應(yīng)(PCR)循環(huán)后產(chǎn)物總量。上海實(shí)時(shí)定量PCR儀價(jià)格便宜
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