談?wù)剶?shù)字PCR那些事數(shù)字PCR即DigitalPCR（dPCR)，它是一種核酸分子定量技術(shù)。相較于qPCR，數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的定量。1、PCR之?dāng)?shù)字PCR技術(shù)發(fā)展歷程在定量PCR時，我們常常糾結(jié)一個問題，究竟是相對定量還是定量呢？如今，你無需糾結(jié)了，因為數(shù)字PCR（digitalPCR）來了。盡管這兩種技術(shù)有些類似，都是估計起始樣品中的核酸量，但它們有一個重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線或參照基因來測定核酸量，而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域：拷貝數(shù)變異、突變檢測、基因相對表達(dá)研究（如等位基因不平衡表達(dá)）、二代測序結(jié)果驗證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。Nacia數(shù)字PCR2、數(shù)字PCR之dPCR檢測原理數(shù)字PCR即DigitalPCR（dPCR)是這幾年才迅速發(fā)展起來的一種核酸定量分析技術(shù)，雖然出生的晚，但是潛力不小，因為數(shù)字PCR解決了qPCR這么多年懸而未決的問題，那就是不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量并且可以將檢測靈敏度提高至單個核酸分子。那它是怎么做到的呢？這要從它的檢測原理說起。Nacia數(shù)字PCR數(shù)字PCR通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元。 實時熒光定量RT-PCR技術(shù)是近年來的新型檢測技術(shù),已成為分子醫(yī)學(xué)/生物學(xué)研究的工具,并在許多領(lǐng)域得到了應(yīng)用.國產(chǎn)PCR儀參考價格

    微滴），包含一個或多個拷貝的核酸分子(也就是說我們所說的DNA模板)，這是與PCR或qPCR反應(yīng)的區(qū)別，PCR或qPCR只在一個反應(yīng)體系中進(jìn)行，而數(shù)字PCR在每個反應(yīng)單元（微滴）中都會對目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后統(tǒng)計熒光信號并分析。數(shù)字PCR檢測其實離我們越來越近，下面我們以幾個臨床案例研究來舉例，展示數(shù)字PCR巨大的臨床應(yīng)用前景。1）.個體化診療通過檢測T790M位點突變情況，可以更好地評估一代TKI藥物的療效及耐藥情況并指導(dǎo)第三代TKI靶向藥Osimertinib的使用。然而，由于qPCR平臺ARMS檢測技術(shù)的靈敏度有限，沒有辦法在含大量EGFR基因野生型背景核酸中高效準(zhǔn)確的檢測到T790M突變。這個時候dPCR技術(shù)展現(xiàn)出了****的檢測精度，此外，dPCR定量的優(yōu)勢也能充分發(fā)揮出來了，可以監(jiān)控突變含量變化，做到及早發(fā)現(xiàn)耐藥。2.）基因表達(dá)分析伊馬替尼（Imatinib）可以有效幫助很多慢性髓細(xì)胞白血?。–ML）患者延長生存期，但是臨床上發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼的療效與BCR-ABL1融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)量有很大的關(guān)系。研究人員采用dPCR對CML患者的BCR-ABL1融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測定，結(jié)果檢測下限可以達(dá)到，顯示出dPCR在痕量核酸檢測方面比qPCR具有無可比擬的優(yōu)勢[2]。 國產(chǎn)PCR儀參考價格PCR儀被大量運用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實驗室中。

    選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。③應(yīng)努力避免3’末端的簡并，對于大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。4．測序引物設(shè)計當(dāng)然，測序引物的設(shè)計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設(shè)計的話；那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計通用標(biāo)準(zhǔn)外，還需要注意兩點：①測序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些，也就是說設(shè)計時更優(yōu)先考慮特異性。因為在測序反應(yīng)中，如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸，會對結(jié)果對來很大的干擾甚至造成結(jié)果無法識讀。②測序引物的Tm值適當(dāng)高一些?，F(xiàn)在大部分測序反應(yīng)均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應(yīng)順利跨過待測模板的二級結(jié)構(gòu)區(qū)，也有助于降低非特異反應(yīng)。5．探針的設(shè)計探針的設(shè)計，根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計特點，這里只是就通用的原則進(jìn)行討論：①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現(xiàn)聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過4個，以免非特異性雜交產(chǎn)生。

力康X960全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)是新推出的實時熒光定量PCR儀，秉承力康品牌一貫的 ，產(chǎn)品具有兩通道和五通道兩種配置選擇，標(biāo)配96孔鍍金模塊，滿足不同應(yīng)用需求。力康X960型全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)是特異性靶基因檢測與定量分析的一體化平臺，將PCR熱循環(huán)儀、熒光檢測和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合于一體，實時動態(tài)觀察PCR每一循環(huán)中每個孔中擴(kuò)增產(chǎn)物情況，無需凝膠電泳分析，無需純化PCR產(chǎn)物，無需進(jìn)行其他任何實驗操作即可快速得到分析結(jié)果。PCR在醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)中的應(yīng)用領(lǐng)域就是對傳染性疾病的診斷。

    一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內(nèi)較好。④引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點、限制酶切位點或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關(guān)序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到5個擴(kuò)增循環(huán)；然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中，計算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5’端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應(yīng)時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學(xué)參數(shù)、從“近鄰位”的計算方式得到，現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計軟件大多數(shù)都采用這種方式。⑤引物的3’末端核苷酸組成引物3’末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結(jié)果是非常重要的。 PCR擴(kuò)增儀通常由熱蓋部件、熱循環(huán)部件、傳動部件、控制部件和電源部件等部分組成。國產(chǎn)PCR儀參考價格

實時熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。國產(chǎn)PCR儀參考價格

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