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談?wù)剶?shù)字PCR那些事數(shù)字PCR即DigitalPCR(dPCR),它是一種核酸分子定量技術(shù)。相較于qPCR,數(shù)字PCR可讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù),是對(duì)起始樣品的定量。1、PCR之?dāng)?shù)字PCR技術(shù)發(fā)展歷程在定量PCR時(shí),我們常常糾結(jié)一個(gè)問(wèn)題,究竟是相對(duì)定量還是定量呢?如今,你無(wú)需糾結(jié)了,因?yàn)閿?shù)字PCR(digitalPCR)來(lái)了。盡管這兩種技術(shù)有些類(lèi)似,都是估計(jì)起始樣品中的核酸量,但它們有一個(gè)重要的區(qū)別。定量PCR是依靠標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或參照基因來(lái)測(cè)定核酸量,而數(shù)字PCR則讓你能夠直接數(shù)出DNA分子的個(gè)數(shù),是對(duì)起始樣品的定量。因此特別適用于依靠Ct值不能很好分辨的應(yīng)用領(lǐng)域:拷貝數(shù)變異、突變檢測(cè)、基因相對(duì)表達(dá)研究(如等位基因不平衡表達(dá))、二代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證、miRNA表達(dá)分析、單細(xì)胞基因表達(dá)分析等。Nacia數(shù)字PCR2、數(shù)字PCR之dPCR檢測(cè)原理數(shù)字PCR即DigitalPCR(dPCR)是這幾年才迅速發(fā)展起來(lái)的一種核酸定量分析技術(shù),雖然出生的晚,但是潛力不小,因?yàn)閿?shù)字PCR解決了qPCR這么多年懸而未決的問(wèn)題,那就是不依賴(lài)于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的定量并且可以將檢測(cè)靈敏度提高至單個(gè)核酸分子。那它是怎么做到的呢?這要從它的檢測(cè)原理說(shuō)起。Nacia數(shù)字PCR數(shù)字PCR通過(guò)將一個(gè)樣本分成幾十到幾萬(wàn)份,分配到不同的反應(yīng)單元。 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR技術(shù)是近年來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù),已成為分子醫(yī)學(xué)/生物學(xué)研究的工具,并在許多領(lǐng)域得到了應(yīng)用.國(guó)產(chǎn)PCR儀參考價(jià)格
微滴),包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的核酸分子(也就是說(shuō)我們所說(shuō)的DNA模板),這是與PCR或qPCR反應(yīng)的區(qū)別,PCR或qPCR只在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行,而數(shù)字PCR在每個(gè)反應(yīng)單元(微滴)中都會(huì)對(duì)目標(biāo)分子進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)束后統(tǒng)計(jì)熒光信號(hào)并分析。數(shù)字PCR檢測(cè)其實(shí)離我們?cè)絹?lái)越近,下面我們以幾個(gè)臨床案例研究來(lái)舉例,展示數(shù)字PCR巨大的臨床應(yīng)用前景。1).個(gè)體化診療通過(guò)檢測(cè)T790M位點(diǎn)突變情況,可以更好地評(píng)估一代TKI藥物的療效及耐藥情況并指導(dǎo)第三代TKI靶向藥Osimertinib的使用。然而,由于qPCR平臺(tái)ARMS檢測(cè)技術(shù)的靈敏度有限,沒(méi)有辦法在含大量EGFR基因野生型背景核酸中高效準(zhǔn)確的檢測(cè)到T790M突變。這個(gè)時(shí)候dPCR技術(shù)展現(xiàn)出了****的檢測(cè)精度,此外,dPCR定量的優(yōu)勢(shì)也能充分發(fā)揮出來(lái)了,可以監(jiān)控突變含量變化,做到及早發(fā)現(xiàn)耐藥。2.)基因表達(dá)分析伊馬替尼(Imatinib)可以有效幫助很多慢性髓細(xì)胞白血?。–ML)患者延長(zhǎng)生存期,但是臨床上發(fā)現(xiàn),伊馬替尼的療效與BCR-ABL1融合基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物表達(dá)量有很大的關(guān)系。研究人員采用dPCR對(duì)CML患者的BCR-ABL1融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果檢測(cè)下限可以達(dá)到,顯示出dPCR在痕量核酸檢測(cè)方面比qPCR具有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[2]。 國(guó)產(chǎn)PCR儀參考價(jià)格PCR儀被大量運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中。
選擇該物種使用頻率高的密碼子,以降低引物的簡(jiǎn)并性。③應(yīng)努力避免3’末端的簡(jiǎn)并,對(duì)于大多數(shù)氨基酸殘基來(lái)說(shuō),意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤(dI)代替簡(jiǎn)并堿基。4.測(cè)序引物設(shè)計(jì)當(dāng)然,測(cè)序引物的設(shè)計(jì)一般都由測(cè)序公司來(lái)完成,如果需要自己設(shè)計(jì)的話(huà);那么除了按照上面所提到的引物設(shè)計(jì)通用標(biāo)準(zhǔn)外,還需要注意兩點(diǎn):①測(cè)序引物的特異性的標(biāo)準(zhǔn)掌握應(yīng)該更嚴(yán)格一些,也就是說(shuō)設(shè)計(jì)時(shí)更優(yōu)先考慮特異性。因?yàn)樵跍y(cè)序反應(yīng)中,如果引物與模板在非預(yù)期位置退火并引發(fā)鏈延伸,會(huì)對(duì)結(jié)果對(duì)來(lái)很大的干擾甚至造成結(jié)果無(wú)法識(shí)讀。②測(cè)序引物的Tm值適當(dāng)高一些。現(xiàn)在大部分測(cè)序反應(yīng)均選用耐熱的測(cè)序級(jí)DNA聚合酶來(lái)催化,并采用PCR的熱循環(huán)程序。選用的測(cè)序引物的Tm值稍高一些,有助于使反應(yīng)順利跨過(guò)待測(cè)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū),也有助于降低非特異反應(yīng)。5.探針的設(shè)計(jì)探針的設(shè)計(jì),根據(jù)不同的用途各有其設(shè)計(jì)特點(diǎn),這里只是就通用的原則進(jìn)行討論:①探針的長(zhǎng)短一般在20-50核苷酸之間,過(guò)長(zhǎng)合成成本高,且易出現(xiàn)聚合酶合成錯(cuò)誤,雜交時(shí)間長(zhǎng)。太短則特異性下降。②注意G和C的含量努力控制在40-60%,同時(shí)一種堿基連續(xù)重復(fù)不超過(guò)4個(gè),以免非特異性雜交產(chǎn)生。
力康X960全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)是新推出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,秉承力康品牌一貫的 ,產(chǎn)品具有兩通道和五通道兩種配置選擇,標(biāo)配96孔鍍金模塊,滿(mǎn)足不同應(yīng)用需求。力康X960型全自動(dòng)醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)是特異性靶基因檢測(cè)與定量分析的一體化平臺(tái),將PCR熱循環(huán)儀、熒光檢測(cè)和各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合于一體,實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察PCR每一循環(huán)中每個(gè)孔中擴(kuò)增產(chǎn)物情況,無(wú)需凝膠電泳分析,無(wú)需純化PCR產(chǎn)物,無(wú)需進(jìn)行其他任何實(shí)驗(yàn)操作即可快速得到分析結(jié)果。PCR在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)中的應(yīng)用領(lǐng)域就是對(duì)傳染性疾病的診斷。
一對(duì)引物的Tm值相差盡量不超過(guò)2~3攝氏度,同時(shí)引物和產(chǎn)物的Tm值也不要相差太大,20攝氏度范圍內(nèi)較好。④引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中,例如T7RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)、限制酶切位點(diǎn)或者GC發(fā)夾結(jié)構(gòu)可以使用加長(zhǎng)的引物。一般說(shuō)來(lái),引物5’端添加無(wú)關(guān)序列不會(huì)影響引物特異序列的退火。有時(shí)候,引物中添加了大量與模板不配對(duì)的堿基,可以在較低退火溫度的條件下進(jìn)行4到5個(gè)擴(kuò)增循環(huán);然后在假定引物5’端序列已經(jīng)加入到模板中,計(jì)算得出的退火溫度下進(jìn)行其余的循環(huán)。在引物上添加限制酶位點(diǎn)時(shí)一個(gè)重要的考慮是大多數(shù)限制酶的有效切割要求在它們的識(shí)別序列的5’端有2至3個(gè)非特異的額外堿基,這樣就會(huì)增加引物的非模板特異序列的長(zhǎng)度。長(zhǎng)引物序列的另一個(gè)缺點(diǎn)是影響溶解溫度的精確計(jì)算,而這對(duì)于確定PCR反應(yīng)時(shí)的退火溫度又是必須的。對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物,Tm值可以根據(jù)Tm=4(G+C)+2(A+T)計(jì)算。而對(duì)于較長(zhǎng)的引物,Tm值需要考慮動(dòng)力學(xué)參數(shù)、從“近鄰位”的計(jì)算方式得到,現(xiàn)有的PCR引物設(shè)計(jì)軟件大多數(shù)都采用這種方式。⑤引物的3’末端核苷酸組成引物3’末端和模板的堿基完全配對(duì)對(duì)于獲得好的結(jié)果是非常重要的。 PCR擴(kuò)增儀通常由熱蓋部件、熱循環(huán)部件、傳動(dòng)部件、控制部件和電源部件等部分組成。國(guó)產(chǎn)PCR儀參考價(jià)格
實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀主要應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)、生物醫(yī)藥研發(fā)、食品行業(yè)、科研院校等。國(guó)產(chǎn)PCR儀參考價(jià)格
力康GM05智能梯度基因擴(kuò)增儀(控溫儀),基于WindowsCE智能化操作系統(tǒng),具備多達(dá)100余項(xiàng)故障自診斷功能。 連接互聯(lián)網(wǎng),用戶(hù)可通過(guò)IE瀏覽器登錄力康官網(wǎng)的下載中心進(jìn)行版本更新,完成PCR儀的遠(yuǎn)程維護(hù)、診斷和數(shù)據(jù)交換, 提高了工作效率。GM05智能梯度基因擴(kuò)增儀(控溫儀)支持觸摸和鼠標(biāo)操作,可外接移動(dòng)U盤(pán),打破傳統(tǒng)PCR儀的按鍵式操作模式,使得編寫(xiě)程序及操作更加靈活方便。GM05智能梯度基因擴(kuò)增儀(控溫儀)率先在行業(yè)領(lǐng)域引入物聯(lián)網(wǎng)概念,具備新一代的信息技術(shù),以互聯(lián)網(wǎng)為基礎(chǔ),實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的延伸與拓展,以一臺(tái)上位機(jī)(PC)為主機(jī),可連接多達(dá)200臺(tái)下位機(jī)(GM05智能梯度基因擴(kuò)增儀/控溫儀)。國(guó)產(chǎn)PCR儀參考價(jià)格
力新儀器(上海)有限公司位于青浦區(qū)盈港東路6868號(hào)1幢二層2082室、2086室。公司自成立以來(lái),以質(zhì)量為發(fā)展,讓匠心彌散在每個(gè)細(xì)節(jié),公司旗下數(shù)字化手術(shù)室,實(shí)驗(yàn)室儀器,新生兒科設(shè)備,ICU重癥產(chǎn)品深受客戶(hù)的喜愛(ài)。公司注重以質(zhì)量為中心,以服務(wù)為理念,秉持誠(chéng)信為本的理念,打造醫(yī)藥健康良好品牌。力新儀器立足于全國(guó)市場(chǎng),依托強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力,融合前沿的技術(shù)理念,飛快響應(yīng)客戶(hù)的變化需求。