時(shí)域法熒光壽命的測(cè)量和熒光壽命成像主要有時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)法（time correlated single photon counting, TCSPC）、門控探測(cè)法（time-gated detection）、條紋相機(jī)測(cè)量法（streak-FLIM）、頻閃技術(shù)等四種常見的方法。TCSPC是目前測(cè)量熒光壽命的主要技術(shù)，同軸脈沖光源發(fā)出的脈沖光引起起始光電倍增管產(chǎn)生電信號(hào)，該信號(hào)通過恒分信號(hào)甄別器1啟動(dòng)時(shí)幅轉(zhuǎn)換器（time-amplitude converter，TAC），時(shí)幅轉(zhuǎn)換器產(chǎn)生一個(gè)隨時(shí)間線性增長(zhǎng)的電壓信號(hào)。此外，同軸脈沖光源發(fā)出的脈沖光通過激發(fā)單色器后到達(dá)樣品池，樣品產(chǎn)生的熒光信號(hào)再經(jīng)過發(fā)射單色器到達(dá)終止光電倍增管，由此產(chǎn)生的電信號(hào)經(jīng)由恒分信號(hào)甄別器2到達(dá)時(shí)幅轉(zhuǎn)換器并使其停止工作。此時(shí)，時(shí)幅轉(zhuǎn)換器根據(jù)累積電壓輸出一個(gè)數(shù)字信號(hào)并在多通道分析儀（multi-channel analyzer）的相應(yīng)時(shí)間通道計(jì)入一個(gè)信號(hào)，表明檢測(cè)到壽命為該時(shí)間的一個(gè)光子。經(jīng)過幾十萬次的重復(fù)后，不同的時(shí)間通道累積下來的光子數(shù)目不相同。熒光壽命成像不受染料濃度的影響；廣州紅外熒光壽命成像哪里有

熒光壽命成像技術(shù)有兩種：時(shí)間域和頻率域。（1）時(shí)域FLIM：需要脈沖光源，所以一般在雙光子的系統(tǒng)上比較常見FLIM（熒光壽命成像Fluorescence Life-time imaging Microcopy簡(jiǎn)稱FLIM），理由一是激光是脈沖的，二是買雙光子的老師一般也搭配一個(gè)FLIM。（2）頻域FLIM：需要一個(gè)相位調(diào)制的光源，有用LED調(diào)制的。熒光壽命成像FLIM的應(yīng)用：1）細(xì)胞體自身熒光壽命分析；2）自身熒光相對(duì)熒光標(biāo)記的有效區(qū)分；3）具有相同頻譜性質(zhì)的不同熒光標(biāo)記的區(qū)分；4）活細(xì)胞內(nèi)水介質(zhì)的PH值測(cè)量；5）局部氧氣濃度測(cè)量；6）活細(xì)胞內(nèi)鈣濃度測(cè)量；7）時(shí)間分辨Forster共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）：納米級(jí)尺度上的遠(yuǎn)程測(cè)量，環(huán)境敏感的FRET探針定量測(cè)量。上海生物熒光壽命成像怎么樣熒光壽命成像有潛力應(yīng)用于瘤識(shí)別，病變?cè)\斷等領(lǐng)域。

熒光壽命成像 (FLIM)通過建立檢測(cè)到的熒光事件的直方圖來確定壽命?？娠@示單指數(shù)或多指數(shù)熒光衰減。數(shù)值曲線擬合表示熒光壽命和振幅（即檢測(cè)到的光子數(shù)）。由于FRET減少了供體壽命，因此如果無FRET的供體壽命已知，就可以量化FRET發(fā)生的程度。該供體壽命τ作為分析FRET樣品的一定參考。因此，F(xiàn)LIM-FRET為內(nèi)部參照—這一特點(diǎn)減少了基于強(qiáng)度測(cè)量FRET時(shí)的很多缺點(diǎn)。由于其熒光壽命是染料的固有特性，因此對(duì)其他不利影響（如光漂白、圖像明暗處理、不同濃度或表達(dá)水平）具有普遍的不變性。使用基于強(qiáng)度的FRET測(cè)量的主要限制是所有可觀察的供體分子都經(jīng)歷FRET的基本假設(shè)。通常情況并非如此。供體分子這種變化的“非結(jié)合”組分給測(cè)量的FRET效率帶來了相當(dāng)大的不確定性，使得無法在實(shí)驗(yàn)之間進(jìn)行比較。熒光壽命成像克服了這一缺點(diǎn)。

影響熒光壽命成像測(cè)量的幾種因素：1．溫度影響：一般說來，熒光隨溫度升高而強(qiáng)度減弱，溫度升高1℃，熒光強(qiáng)度下降1～10%不等。測(cè)定時(shí)，溫度必須保持恒定。 2．PH值影響：PH 值影響物質(zhì)的熒光，應(yīng)選擇較佳PH制備樣品。 3．光分解對(duì)熒光測(cè)定的影響： 熒光物質(zhì)吸收紫外可見光后，發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。因此，熒光分析要采用高靈敏度的檢測(cè)器，而不是用增強(qiáng)光源來提高靈敏度。測(cè)定時(shí)，用較窄的激發(fā)光部分的狹縫，以減弱激發(fā)光。同時(shí)，用較寬的發(fā)射狹縫引導(dǎo)熒光。熒光分析應(yīng)盡量在暗環(huán)境中進(jìn)行。熒光壽命成像已用于骨骼和牙齒的診斷。

熒光分析和成像技術(shù)因具有非常高的靈敏度和分子特異性而普遍的應(yīng)用于生物物理、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、物理、化學(xué)等領(lǐng)域，利用熒光光譜技術(shù)和熒光顯微技術(shù)可以分析樣品中熒光團(tuán)的組分和分布。不過，由于熒光分析技術(shù)大多是基于熒光強(qiáng)度的測(cè)量，容易受到激發(fā)光強(qiáng)度、樣品濃度淬滅、熒光染料的分布濃度等因素的影響。熒光壽命通常來講是一定的，不受激發(fā)光強(qiáng)度、熒光團(tuán)濃度等因素的影響，只只與熒光團(tuán)所處的微環(huán)境有關(guān)，因此，利用熒光壽命顯微鏡（Fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM）對(duì)樣品進(jìn)行熒光壽命成像，可以對(duì)樣品所在的微環(huán)境中的許多物理參數(shù)如氧壓、溶液疏水性等及生物化學(xué)參數(shù)如pH值、離子濃度等進(jìn)行定量測(cè)量。此外，熒光壽命成像技術(shù)還可以同時(shí)獲得分子狀態(tài)和空間分布的信息。熒光壽命成像(FLIM)可用于測(cè)量分子環(huán)境參數(shù)。福建三維熒光壽命成像有哪些

熒光壽命可以在頻域或者時(shí)間域測(cè)量。廣州紅外熒光壽命成像哪里有

熒光壽命成像或FLIM是基于熒光樣品中不同區(qū)域的熒光的指數(shù)衰減速率的差異。由τ決定熒光壽命成像的每個(gè)像素的強(qiáng)度，這使研究人員可以查看具有不同熒光衰減率的材料之間的對(duì)比度，還可以產(chǎn)生顯示其他衰減路徑變化的圖像?？梢酝ㄟ^使用脈沖源在時(shí)域中確定熒光壽命。當(dāng)熒光物質(zhì)被超短脈沖激發(fā)時(shí)，時(shí)間分辨的熒光將呈指數(shù)衰減。時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)（tcspc）通常被用作熒光壽命的測(cè)量方法，因?yàn)樗a(bǔ)償了在源強(qiáng)度和單光子的脈沖幅度的變化。更具體地說，TCSPC由單個(gè)光子雪崩光電二極管（SPAD）記錄相對(duì)于激發(fā)激光脈沖的單個(gè)光子的壽命。重復(fù)記錄多個(gè)激光脈沖，并在記錄了足夠多的事件后，研究人員能夠建立所有這些記錄的時(shí)間點(diǎn)上事件數(shù)量的直方圖。然后，可以將該直方圖擬合到的指數(shù)壽命衰減函數(shù)的指數(shù)函數(shù)，并且可以相應(yīng)地提取壽命參數(shù)。廣州紅外熒光壽命成像哪里有

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