熒光壽命成像FLIM相比于熒光強度成像更有優(yōu)勢。通過熒光強度成像可以獲得熒光分子的空間分布,較為直接和簡便,但是當熒光分子具有相似的頻譜特性,或是同樣的熒光分子在不同環(huán)境下時,依賴強度進行成像的方案便無法準確反映信息。與基于光強的成像方式不同,熒光壽命成像FLIM適用于測量熒光分子環(huán)境的變化,或是測量分子的運動情況。其結果與熒光分子濃度無關,且不受影響光強的光散射或是光吸收影響,可以精確測量熒光淬滅過程,對生物分子微環(huán)境進行定量測量。熒光壽命成像已用于骨骼和牙齒的診斷。顯微熒光壽命成像操作步驟
熒光壽命成像可以提供熒光強度(光子數(shù))和光子壽命的空間分布,具有200 nm的空間分辨率和皮秒量級的時間分辨率。通過雙光子激發(fā)(結合飛秒脈沖和共焦顯微鏡)可以直接檢測熒光和時間分辨的熒光壽命。這種無損檢測技術,無需解剖或專門制造分層樣品,不但可在樣品表面,還可在樣品表面以下實現(xiàn)深度解析測量。特別適用于新材料、光子學、光伏、光催化、生物材料、納米材料和納米復合材料以及其相關的原理探究和設計優(yōu)化。熒光壽命成像圖像中每一個像素點在phasor圖上都有一個對應的點。因此我們可以獲取每個像素點的壽命信息,也可以獲知每一壽命所對應的圖像區(qū)域。珠海生物熒光壽命成像哪個牌子好熒光壽命成像這種技術相對較新,涉及到同時在圖像的每個像素處確定熒光衰減時間的空間分布。
熒光壽命成像和生物發(fā)光的異同點是什么?生物發(fā)光與熒光壽命成像不同點:產生光子的原理不同,類似于我們都是通過肉眼去觀察螢火蟲和發(fā)光水母一樣,生物發(fā)光與熒光成像在本質上,都是機體中特定的細胞或材料發(fā)出光子,被高靈敏度的CCD檢測到形成圖像,但是生物發(fā)光與熒光壽命成像產生光子的過程和機制是完全不同的。生物發(fā)光與熒光成像相同點:都需要對細胞進行標記。生物發(fā)光產生的光子和熒光壽命成像產生的光子都可以被高靈敏的CCD檢測并形成圖像,就像一個人的眼睛就可以既看到螢火蟲又可以看到發(fā)光水母一樣。除此之外,生物發(fā)光和熒光壽命成像都需要對目標細胞進行標記,讓細胞產生熒光素酶或者熒光蛋白。
熒光壽命成像中的熒光壽命及其含義:假定一個無限窄的脈沖光(δ函數(shù))激發(fā)n0個熒光分子到其激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和knr,則激發(fā)態(tài)衰減速率可表示為:其中n(t)表示時間t時激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目,由此可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程。熒光壽命定義為衰減總速率的倒數(shù):熒光強度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù),因此可將上式改寫為:其中I0是時間為零時的熒光強度,τ為熒光壽命。也就是說熒光強度衰減到初始強度的1/e時所需要的時間就是該熒光物種在測定條件下的熒光壽命。實際上用熒光強度的對數(shù)對時間作圖,直線斜率即為熒光壽命倒數(shù)的負值。熒光壽命也可以理解為熒光物種在激發(fā)態(tài)的統(tǒng)計平均停留時間。事實上當熒光物質被激發(fā)后有些激發(fā)態(tài)分子立即返回基態(tài),有的甚至可以延遲到5倍于熒光壽命時才返回基態(tài),這樣就形成了實驗測定的熒光強度衰減曲線。熒光壽命成像不需要考慮跳色的影響,從而免去了計算和去除跳色雜質信號的麻煩;
受光學衍射極限的限制,熒光顯微技術的空間分辨率只能達到200納米左右,難以滿足生命科學研究的需要。而對于熒光壽命成像來說,其空間分辨率受衍射極限的影響尤為嚴重。熒光壽命成像是一個新興的研究領域,尋求具有高度原創(chuàng)性的技術原理與方案,并率先解決熒光壽命成像在生命科學應用中存在的難題,具有重大的科學意義與應用價值。一種熒光壽命成像方法,所述方法包括下述步驟:對標記于樣品中的光開關染料分子進行稀疏激勵;激發(fā)樣品中被激勵的光開關染料分子,收集被激發(fā)的光開關染料分子所發(fā)射的光子并記錄光開關染料分子的熒光圖像,對熒光圖像中的光開關染料分子進行質心定位;對在質心定位處接收到的光子進行計數(shù),確定被激發(fā)的光開關染料分子的熒光壽命;結合得到的光開關染料分子的質心定位結果和熒光壽命,構建熒光壽命圖像。熒光壽命成像是一種重要的熒光顯微鏡技術。佛山生物熒光壽命成像原理
熒光壽命顯微成像是熒光壽命測量和熒光顯微技術的結合。顯微熒光壽命成像操作步驟
熒光壽命可以在頻域或者時間域測量。時間域測量方法涉及用短光脈沖照射樣品(比色皿、細胞或組織),然后隨時間測量發(fā)射強度。FLT由衰減曲線的斜率確定。有幾種熒光檢測方法可用于壽命測量,其中時間相關單光子計數(shù)(TCSPC)可實現(xiàn)簡單的數(shù)據(jù)收集和增強的定量光子計數(shù)。頻域方法涉及高頻率入射光的正弦調制。在該方法中,發(fā)射發(fā)生在與入射光相同的頻率處,并且隨著激發(fā)光兼有相位延遲和振幅的變化(解調)。壽命測量不需要波長比率探針來提供眾多分析物的定量測定。壽命法通過使用光譜位移探針擴展了分析物濃度范圍的靈敏度。壽命測量可用于沒有直接探針的分析物。包括葡萄糖、抗原或基于熒光能量轉移轉導機制的任何親和力或免疫測定。顯微熒光壽命成像操作步驟
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